Методика спектрофотометрических измерений
Существует два типа спектрофотометров: однолучевые и двухлучевые.
В однолучевом приборе луч света, выходящий из монохроматора, проходит через одну кювету и затем попадает в детектор. Определение поглощения производят следующим образом. Вначале прибор устанавливают на нуль пропускаемости (бесконечная величина поглощения) с детектором в темноте, что делается для компенсации слабого тока, который имеется даже при отсутствии излучения и возникает вследствие эмиссии тепловых электронов. Затем в луч помещают кювету, содержащую растворитель, и прибор устанавливается для измерения в единицах пропускаемости (нуль поглощения) при определенной длине волны. Наконец, кювету с растворителем заменяют кюветой с раствором исследуемого вещества и производят измерение.
По этой методике измеряют два фототока - один пропорциональный интенсивности луча, прошедшего через растворитель, и второй - пропорциональный интенсивности луча, прошедшего через раствор вещества. Чтобы соотношения этих токов были эквивалентны пропускаемости, надо источник излучения и детектор оставлять постоянными в пределах, когда пропускаемость установлена на единицу и когда пропускаемость уменьшается при измерении поглощения вещества. Следовательно, особое внимание необходимо обращать на постоянное напряжение, подающееся на лампу.
В двухлучевом спектрофотометре эта проблема разрешена следующим образом. Излучение, выходящее из монохроматора, разделяется на два луча, имеющие одинаковые интенсивности и спектральные распределения. Один из лучей проходит через кювету с растворителем, другой - через кювету с исследуемым веществом. На отношение излучений, выходящих из обеих кювет, величина источника света не оказывает никакого влияния. Отношение излучений может быть измерено двумя способами.
Лучи, вышедшие из кювет, направляются на катоды двух фотоэмиссионных ламп или фотоумножителей. Выходы этих детекторов связаны серией сопротивлений, усиливают разницу между двумя фототоками и регистрируют величину поглощения. Удобством двухлучевых приборов является возможность регистрации показаний.
В приборах с одним детектором лучи, выходящие из двух кювет, направляются на ту же часть катода одной лампы. При помощи вращающегося непрозрачного диска лучи разбиваются на отдельные порции. Таким образом, на детектор падает излучение, интенсивность которого меняется в пределах I и I0, и его выход меняется с той же скоростью, что и скорость вращения диска. Это создает напряжение, амплитуда которого будет пропорциональна разнице в интенсивности двух лучей. Дальнейшее измерение напряжения, соответствующего интенсивности лучей, зависит от конструкции прибора.
Обычно для получения спектров требуется от 0,1 до 100 мг вещества в зависимости оу молярного коэффициента поглощения. Растворы, применяемые в спектрофотометрии, являются очень разведенными, что обусловливает необходимость точного взвешивания образца и точного отмеривания раствора при последующих разведениях. Подходящей для измерений концентрацией является та, которая обеспечивает показания поглощения между 0,2 и 0,7, что соответствует пропускаемости от 65 до 20%.
Определенное повышение точности спектрофотометрического анализа достигается путем, так называемой дифференциальной фотометрии. Этот метод основан на сравнении поглощения неизвестного раствора и поглощения стандартного раствора, последний подобран таким образом, что разница в поглощениях будет находиться в пределах, в которых измерение может быть выполнено с достаточной точностью. Дифференциальный способ принят Скандинавской фармакопеей в качестве основного метода для спектрофотометрических определений.