Отклонение от закона Ламберта - Бера

Отклонения от закона Ламберта - Бера могут быть обусловлены различными изменениями с анализируемым веществом или относятся к недостаткам прибора. Нарушение закона иногда является результатом изменения концентрации растворенного вещества вследствие ассоциации между молекулами растворенного вещества или между молекулами растворенного вещества и растворителя, или вследствие ионизации, что часто зависит от природы растворителя.

Ширина щели является одной из наиболее важных переменных величин в спектрофотометрии. Чистота (монохроматизм) излучения частично зависит от ширины щели. Относительная интенсивность полосы при любой длине волны будет неодинаковой; наивысшая интенсивность приходится на центр полосы и уменьшается к ее краям. Если входную щель уменьшить, относительная интенсивность становится более однородной. Однако нельзя уменьшать ширину щели бесконечно, существует предельная величина (оптимальная ширина щели), за которой любое уменьшение щели снижает интенсивность излучения. Центр полосы, имеющий максимальную интенсивность, называется средней длиной волны и является величиной, отмечаемой на шкале длин волн.

Ширина щели имеет большое значение при анализе веществ с узкими адсорбционными полосами. Если используется слишком широкая щель, то существует возможность, что измерение будет выполнено при длинах волн на каждой стороне острого максимума («пика»), в связи с чем показание (величина) поглощения окажется низким.

Имея в виду этот факт, Британская фармакопея указывает, что при измерении поглощения три максимуме адсорбции ширина спектральной щели должна быть меньше половины ширины полосы поглощения, иначе может быть ошибочно определена низкая величина поглощения. Особенно внимательно нужно относиться к измерениям таких веществ, как апоморфина гидрохлорид, хингамин, дийодгидроксихинолин, нафазолина нитрат, папаверина гидрохлорид и проциклидина гидрохлорид, которые имеют очень узкую полосу поглощения.

При обычных рабочих условиях ширина полосы составляет от 1 до 5 нм на щель, что является удовлетворительным, за исключением узких максимумов.

Возможные ошибки независимо от ширины щели вероятны в случае, если излучение источника и чувствительность фотоэлемента низкие, пропускаемость растворителя, кювет или призм неудовлетворительная вследствие старения, загрязнения, повреждения или если определение проводится на пределе возможной области.

С призменными инструментами ширина полосы, соответствующая установленной ширине щели, не является постоянной по всей шкале волн, так как разрешение спектра изменяется с длиной волны и увеличивается с ее уменьшением. Настройка ширины щели не является необходимой для ряда приборов, в которых всегда используются условия максимальной чувствительности.

Большинство спектрофотометрических измерений проводится в растворах. В качестве растворителей для области от 220 до 780 нм используются дистиллированная вода, метиловый, этиловый и другие спирты, диоксан, эфиры и низшие углеводороды. При выборе растворителя важно, чтобы он не поглощал в той же части спектра, что и растворенное вещество. Для получения спектроскопически чистых растворителей последние подвергают дополнительной очистке. Проба растворителей на отсутствие бензола может быть выполнена путем измерения поглощения в области от 230 до 265 нм, образцом для сравнения служит дистиллированная вода.

Британская фармакопея определяет, что «при измерении поглощения раствора при определенной длине волны поглощение контрольной кюветы и растворителя не должно превышать 0,4 и в общем должно быть меньше чем 0,2, когда измеряется по отношению к воздуху при той же длине волны». Растворители должны быть свободны от флюоресценции, что может привести к возникновению эффекта рассеяния света и последующей ошибке при измерении.